陶瓷研缽堿變性提取質粒DNA是基于染色體DNA與質粒DNA的變性與復性的差異而達到分離目的。在pH高達12.6的堿性條件下,染色體DNA的氫鍵斷裂,雙螺旋結構解開而變性。質粒DNA的大部分氫鍵也斷裂,但超螺旋共價閉合環狀的兩條互補鏈不會完全分離,當以pH4.8的NaAc高鹽緩沖液去調節其pH至中性時,變性的質粒DNA又恢復原來的構型,陶瓷研缽保存在溶液中,而染色體DNA不能復性而形成纏連的網狀結構,通過離心,染色體DNA與不穩定的大分子RNA、蛋白質-SDS復合物等一起沉淀下來而被除去。
陶瓷研缽注意事項
1. 當RNApure Reagent用量少于2ml時建議使用清潔的一次性的聚丙烯材質試管。
2. 當RNApure Reagent用量較大時,可以使用玻璃試管(Corex)或聚丙烯材質試管,事先檢驗以確保該試管可以耐受加入RNApure Reagent和氯仿后12,000×g的離心力。不可使用有裂縫或者破損的試管。
3. 離心前小心平衡試管。
4. 離心前玻璃管口必須蓋上鋁箔并用石蠟膜封口,聚丙烯管必須蓋緊。
5. 從少量的組織(1~10mg)或細胞(102~104)中分離RNA樣品:調整樣品體積到0.25ml,往組織或細胞中加入0.75ml RNApure Reagent。陶瓷研缽待樣品裂解后,加入氯仿并進行步驟2中的抽提操作。在用異丙醇沉淀RNA之前,加入5~10μg無RNA酶的glycogen作為水樣層的載體。為降低其黏度在加入氯仿前用26號注射器抽吸兩次以切斷基因組DNA。Glycogen會留在水樣層中并和RNA共析出。在濃縮到4mg/ml之前它不會抑制逆轉錄反應**鏈的合成也不會抑制PCR。
6. 在勻漿化后和加入氯仿之前,樣品可以在–60~–70°C保存至少一個月。RNA沉淀(步驟4,RNA漂洗)放置于75%的乙醇在2~8°C至少可以保存一周,在–5~–20°C下至少可保存一年。
7. 臺式離心機陶瓷研缽*大能達到2,600×g的離心力的,如果將離心時間延長到30~60分鐘可以滿足步驟2和步驟3中的操作。
滬公網安備 31011702004356號