單細胞懸浮液熒光定量PCR技術,即是在PCR反應體系中加入熒光物質,利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程,對未知模板進行定量分析的方法。具有應用范圍廣,靈敏度高,操作簡便、特異性和可靠性更強、自動化程度高、無污染、具實時性和準確性等特點。
RNA提?。?/span>Trizol法)
Trizol試劑中的主要成分為異硫氰酸胍和苯酚,其中異硫氰酸胍可裂解細胞,促使核蛋白體的解離,使RNA與蛋白質分離,單細胞懸浮液劑并將RNA釋放到溶液中。當加入氯仿時,它可抽提酸性的苯酚,而酸性苯酚可促使RNA進入水相,離心后可形成水相層和有機層,這樣RNA與仍留在有機相中的蛋白質和DNA分離開。水相層(無色)主要為RNA,有機層(黃色)主要為DNA和蛋白質。
單細胞懸浮液實驗步驟:
1. RNA的提取;
2. 反轉錄合成cDNA;
3. PCR擴增;
4. 產物的電泳和結果的測定。
單細胞懸浮液送樣要求:
1、組織樣本:-20℃或-80℃低溫冰箱中保存,液氮或者干冰運輸;市內或短途運輸可冰袋運輸。若提供的材料為新鮮組織、血液細胞等生物材料,請提供足夠提取2ug以上基因DNA的材料量。
2、DNA樣本:體積≥50ul,濃度≥50ng/ul,DNA總量≥2ug,純度 OD260/280 在1.7~1.9之間,不含PCR抑制劑,須注明準確濃度。樣品須低溫冰袋運輸。
3、血液樣本:要求保存于抗凝管中或凍存管中,體積大于2ml,請用干冰運送,保證DNA不降解。
4、樣品為石蠟包埋組織切片的,單細胞懸浮液要求提供10張組織切片光片(面積>10mm×10mm,厚度約5-10um)。
滬公網安備 31011702004356號