雞腦源性神經營養因子(BDNF)檢測試劑盒
使用說明書
雞腦源性神經營養因子(BDNF)檢測試劑盒檢測原理:
本試劑盒采用雙抗體夾心法:抗雞腦源性神經營養因子(BDNF)單抗包被于酶標板上,標本和標準品中的腦源性神經營養因子(BDNF)會與單抗結合,游離的成份被洗去。加入酶標抗體,抗雞腦源性神經營養因子(BDNF)抗體與結合在單抗上的雞腦源性神經營養因子(BDNF)結合而形成**復合物,游離的成分被洗去。加入顯色底物,若反應孔中有腦源性神經營養因子(BDNF),辣根過氧化物酶會使無色的顯色劑現藍色,加終止液變黃。在450nm處測OD值,腦源性神經營養因子(BDNF)濃度與OD450值之間呈正比,可通過繪制標準曲線求出標本中的腦源性神經營養因子(BDNF)濃度。
選用世界有名生產廠家的原料,采用專業體外診斷試劑生產技術制造。適用于體外定量檢測雞血清、血漿或細胞培養上清液中天然重組雞腦源性神經營養因子(BDNF)濃度。僅供科研使用,使用前請仔細閱讀說明書并檢查試劑組分。
雞腦源性神經營養因子(BDNF)檢測試劑盒組成:
中文名稱
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英文名稱
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規格
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保存
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ELISA酶標板(可拆卸)
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Micro ELISA Plate(Dismountable)
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8×12 / 8×6*
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4℃/-20℃ #
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凍干標準品
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Reference Standard
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2/1 支*
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4℃/-20℃ #
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標準品&樣品稀釋液
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Reference Standard & Sample Diluent
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1瓶 20mL/12mL*
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4℃
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濃縮生物素化抗體
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Concentrated Biotinylated Detection Ab
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1支 120μL/70μL*
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4℃/-20℃ #
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生物素化抗體稀釋液
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Biotinytated Detection Ab Diluent
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1瓶 10mL/6mL*
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4℃
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濃縮HRP酶結合物
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Concentrated HRP Conjugate
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1支 120μL/70μL*
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4℃(避光)
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酶結合物稀釋液
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HRP Conjugate Diluent
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1瓶 10mL/6mL*
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4℃
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濃縮洗滌液(25×)
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ConcentratedWashBuffer (25×)
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1瓶 30mL/16mL*
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4℃
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底物溶液(TMB)
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Substrate Reagent
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1瓶 10mL/6mL*
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4℃(避光)
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反應終止液
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Stop Solution
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1瓶 10mL/6mL*
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4℃
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封板覆膜
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Plate Sealer
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5/3 張*
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產品說明書
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Product Description
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1 份
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質檢報告
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Certificate of Analysis
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1 份
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特別說明:
*: [96T/48T](打開包裝后請及時檢查所有物品是否齊全完整)
#: 一周內使用可存于4℃,需長時間存放或多次使用建議存于-20℃.
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相關試劑在分裝時會比標簽上標明的體積稍多一些,請在使用時量取而非直接倒出!
雞腦源性神經營養因子(BDNF)檢測試劑盒樣品收集:
1. 血清:全血樣品于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000×g離心20分鐘,取上清即可檢測,收集血液的試管應為一次性的無熱原,無內**試管。
2. 血漿:抗凝劑推薦使用EDTA-Na2,樣品采集后30分鐘內于1000×g離心15分鐘,取上清即可檢測。避免使用溶血,高血脂樣品。
3. 組織勻漿:用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織,去除殘留血液(勻漿中裂解的紅細胞會
影響測量結果),稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS(一般按1:9的重量體積比,比如1g的組織樣品對應9mL的PBS,具體體積可根據實驗需要適當調整,并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中,于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞,可以對勻漿液進行超聲破碎,或反復凍融。*后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘,取上清檢測。
4. 細胞培養上清:取細胞培養上清于1000×g離心20分鐘,除去雜質及細胞碎片。取上清檢測。
5. 其它生物樣品:1000×g離心20分鐘,取上清即可檢測
6. 樣品應清澈透明,懸浮物應離心去除。
7. 樣品收集后若在1周內進行檢測的可保存于4℃,若不能及時檢測,請按一次使用量分裝,凍存于-20℃(1個月內檢測),或-80℃(6個月內檢測),避免反復凍融。
8. 如果您的樣品中檢測物濃度高于標準品*高值,請根據實際情況,做適當倍數稀釋(建議先做預實驗,以確定稀釋倍數)。
試驗所需自備物品:
1. 酶標儀(450nm波長濾光片)
2. 高精度移液器,EP管及一次性吸頭:0.5-10μL, 2-20μL,
20-200μL, 200-1000μL
3. 37℃恒溫箱,雙蒸水或去離子水
4. 吸水紙
雞腦源性神經營養因子(BDNF)檢測試劑盒檢測前準備工作:
1. 請提前20分鐘從冰箱中取出試劑盒,平衡至室溫。
2. 將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:25)。未用完的放回4℃。從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結晶,屬于正?,F象,可用40℃水浴微加熱使結晶完全溶解后再配制洗滌液(加熱溫度不要超過50℃,使用時洗滌液應為室溫)。當日使用。
3. 標準品: 于10000×g離心1分鐘,加入標準品&樣品稀釋液1.0mL至凍干標準品中,旋緊管蓋,靜置10分鐘,上下顛倒數次,待其充分溶解后,用移液器將其輕輕混勻(濃度為10ng/mL。)。然后根據需要進行倍比稀釋(注:不要直接在反應孔中進行倍比稀釋)。建議配制成以下濃度:按照稀釋方法圖例 標準品&樣品稀釋液直接作為空白孔0ng/mL。如配制5ng/mL標準品:取0.5mL10ng/mL的上述標準品加入含有0.5mL標準品&樣品稀釋液的EP管中,混勻即可,其余濃度依此類推。
4. 生物素化抗體工作液:實驗前計算當次實驗所需用量(以100μL/孔計),實際配制時應多配制100-200μL。使用前15分鐘,以生物素化抗體稀釋液稀釋濃縮生物素化抗體(1:100)成工作濃度。當日使用。
5. 酶結合物工作液:實驗前計算當次實驗所需用量(以100μL/孔計),實際配制時應多配制100-200μL。使用前15分鐘,以酶結合物稀釋液稀釋濃縮HRP酶結合物(1:100)成工作濃度。
當日使用。
標準品稀釋方法圖例:(以500μL/管為例,也可根據實際用量來稀釋,如200μL/管)
洗滌方法:
任何一個成功的ELISA檢測,正確的洗板方法是非常關鍵和重要的一方面。連貫的洗板也很有必要的。在稀釋濃縮洗滌液時,請使用去離子水或者蒸餾水。
◆ 洗滌瓶或多通道移液器
保證洗瓶內壓強良好或者移液器的管頭被適當調整并且無碎屑。檢查板內的板條是否安好。將板條編號以防在傾泄的時候松動便于調整。首先,傾泄酶標板以清空內容物。根據試劑盒內推薦的體積向每孔內滴加洗液。若實驗步驟中要求浸泡,則定時將每孔浸泡完全。將板內液體傾倒完全,用干凈紙巾擦拭。按照說明書所示重復以上步驟。*后一次洗板之后,將板內液體傾倒完全,用干凈紙巾拍打表面并擦干。切勿讓孔內干燥。按照試劑盒內說明書迅速進行下一步實驗操作。
◆ 自動洗板儀
將自動洗板儀接入適當真空(根據制造商的說明)。確保每管都被適當抽吸。首先,通過吸或者傾倒將板清空。根據試劑盒內推薦的體積向每孔內滴加洗液。若實驗步驟中要求浸泡,則定時將每孔浸泡完全。完全抽吸各孔,保證沒有洗液殘留。在孔內液體被完全抽走之后不要再將裝置至于孔內過分抽吸。按照說明書所示重復以上步驟。*后一次洗板之后,將板內液體傾倒完全,用干凈紙巾拍打表面并擦干。切勿讓孔內干燥。按照試劑盒內說明書迅速進行下一步實驗操作。
操作步驟:
實驗開始前,各試劑均應平衡至室溫;試劑或樣品配制時,均需充分混勻,并盡量避免起泡。
1. 加樣:分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔??瞻卓准訕藴势?amp;樣品稀釋液 100μL,余孔分別加標準品或待測樣品 100μL,注意不要有氣泡,加樣時將樣品加于酶標板底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻。給酶標板覆膜,37℃孵育 90 分鐘。為保證實驗結果有效性,每次實驗請使用新的標準品溶液。
2. 棄去液體,甩干,不用洗滌。每個孔中加入生物素化抗體工作液 100μL(在使用前15 分鐘內配制),酶標板加上覆膜,37℃溫育 1 小時。
3. 棄去孔內液體,甩干,洗板 3 次,每次浸泡 1-2 分鐘,大約 350μL/每孔,甩干并在吸水紙上輕拍將孔內液體拍干。
4. 每孔加酶結合物工作液(臨用前 15 分鐘內配制)100μL,加上覆膜,37℃溫育30 分鐘。
5. 棄去孔內液體,甩干,洗板5 次,方法同步驟3。
6. 每孔加底物溶液(TMB)90μL,酶標板加上覆膜37℃避光孵育15 分鐘左右(根據實際顯**況酌情縮短或延長,但不可超過30 分鐘。當標準孔出現明顯梯度時,即可終止)。
7. 每孔加終止液 50μL,終止反應,此時藍色立轉黃色。終止液的加入順序應盡量與底物溶液的加入順序相同。
8. 立即用酶標儀在 450nm 波長測量各孔的光密度(OD 值)。應提前打開酶標儀電源,預熱儀器,設置好檢測程序。
9. 實驗完畢后將未用完的試劑按規定的保存溫度放回冰箱保存。
雞腦源性神經營養因子(BDNF)檢測試劑盒注意事項:
◆ 仔細閱讀說明書。
◆ 檢查試劑盒標簽上的有效期。如果超過有效期,請勿使用。
◆ 按說明書確定所有試劑齊全(數量、體積)。
◆ 標本制備要規范,每份標本體積要按2-3個復孔以上的量制備(貯存),盡量分裝做備份。短期內無法實驗者,注意低溫保存。
◆ 準備好所有實驗額外所需物品,(比如移液器,試管,清洗器,酶標儀)。
◆ 按說明書將所用試劑平衡至室溫,根據檢測標本數量確定所需試劑的量。
◆ 檢查試劑盒內每種試劑的貯存條件,保證所有試劑均按照試劑盒內說明書推薦的條件存儲。
◆ 檢查不穩定或者變質的試劑溶液(比如沉淀或變色)。有些試劑,比如標準品稀釋液或者檢測稀釋液,可能在設計時就含有沉淀物。所有試劑在滴入酶標板之前,必需充分混勻。而由于沉淀物的特性,在加入酶標板之前,必需不停攪拌。
◆ 保證充分的孵育時間和溫度。
◆ 切勿使用不同生產批號的試劑取代現有試劑或混合現有試劑。
◆ 在混合或溶解蛋白溶液時,避免泡沫產生。
◆ 在實驗開始之前,安排好實驗流程。
◆ 在實驗開始之前,清潔工作臺。
◆ 若有問題,應與我公司或代理商的技術支持聯系
結果判斷:
1. 每個標準品的OD值減去空白孔的OD值后作圖,如設置復孔,則應取其平均值計算。以標準品的濃度為橫坐標,OD值為縱坐標,繪出標準曲線。亦可以OD值為橫坐標,標準品的濃度為縱坐標,繪出標準曲線。
2. 推薦使用專業的曲線制作軟件,如curve expert 1.3或1.4,在軟件界面既可根據樣品OD值,由標準曲線查出相應的濃度,乘以稀釋倍數;亦可將樣品的OD值代入標準曲線的擬合方程式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數,即為樣品的實際濃度。
3. 若樣品OD值高于標準曲線上限,應適當稀釋后重測,計算濃度時應乘以稀釋倍數。
雞腦源性神經營養因子(BDNF)檢測試劑盒靈敏度、檢測范圍、特異性和重復性:
●靈敏度:*小可測:0.034 ng/mL
●檢測范圍:0.156-10ng/mL
● 重復性:板內,板間變異系數均<10%。
● 特異性:可檢測重組或天然的雞腦源性神經營養因子(BDNF),且與其它相關蛋白無交叉反應。
操作概要
1. 在各孔中加入標準品或樣品各 100μL, 37℃孵育 90 分鐘
2. 倒去孔內液體,加入 100μL 生物素化抗體工作液,37℃孵育 60 分鐘
3. 洗滌 3 次
4. 加入 100μL 酶結合物工作液, 37℃孵育 30 分鐘
5. 洗滌 5 次
6. 加入 90μL 底物溶液, 37℃孵育 15 分鐘左右
7. 加入 50μL 終止液,立即在 450nm 波長處測量 OD 值
8. 結果計算
問題分析
若實驗效果不好,請及時對顯色結果拍照,保留所用板條及未使用試劑,并妥善保存,然后
聯系我公司技術支持為您解決問題。
我是按照實驗步驟進行測定的,但是沒有任何信號,為什么?
◆ 對于使用HRP底物的比色測定,終止液的加入會使底物變色。而說明書推薦的波長就是*適波長。
◆ 通過輕拍酶標板的邊緣充分混合孔內試劑。加入終止液的時,顏色由藍變黃(如果是HRP
底物)。如果加終止液之前孔內試劑沒有混合,則底物顏色變綠。
◆ 可能加入試劑的順序錯誤。
◆ 加入底物溶液以后不要清洗酶標板。
◆ 在連續稀釋時確定已經加入標準品。
◆ 如果底物系統中有兩個成分,則必需混合均勻。
◆ 確定酶標儀的使用和操作正確。
◆ 確定試劑,標準品,樣品都正確配制并按照說明滴加無誤。
◆ 對于高敏感性試劑盒,確定使用的底物和放大劑都正確稀釋。